南極熱敏UDG試劑是來源于嗜冷海洋細(xì)菌經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化的的重組蛋白，又稱南極熱敏UDG。該熱敏UDG酶能有效地水解單鏈或雙鏈 DNA 上的尿嘧，產(chǎn)生的缺嘧啶位點(diǎn)，在高溫或高 pH 下，極易水解斷裂。該熱敏UDG酶對RNA無活性，主要用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染。大腸桿菌來源的尿嘧-DNA 糖基化酶較為耐熱，經(jīng)95℃10min處理仍會殘留有少量的尿嘧-DNA 糖基化酶活性，導(dǎo)致含有dU堿基的PCR產(chǎn)物的降解。而來源于嗜冷海洋細(xì)菌的熱敏UDG在50℃ 5min即失活，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，在PCR混合液中添加尿嘧-DNA 糖基化酶（熱敏性），25℃ 2min即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，由于尿嘧-DNA 糖基化酶（熱敏性）在PCR循環(huán)的94℃變性一步便可被滅活，因此不會影響新的含dU的PCR產(chǎn)物。

應(yīng)用

去除單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧堿基

去除 PCR 殘存污染

活性定義

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，37°C每分鐘催化60 pmol 尿嘧從含尿嘧的雙鏈DNA上釋放所需要的酶量為一個(gè)活性單位。

反應(yīng)buffer

ThermoLabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)與絕大多數(shù)的PCR 聚合酶反應(yīng)緩沖液都是兼容的，但在高離子濃度(>100mM)下活性會受到抑制。

酶保存液

20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。

儲存

-20℃可保存2年。

熱失活

50℃，5min。

南極熱敏UDG試劑恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測結(jié)果，可以看到檢測反應(yīng)<20min(達(dá)平臺期)。

應(yīng)用實(shí)例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。OG變色法為終點(diǎn)變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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