動物細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法有哪些

動物細(xì)胞原代培養(yǎng)是直接從活體組織中分離細(xì)胞并進(jìn)行shou次培養(yǎng)的技術(shù)，其核心是將組織塊分散為單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，再模擬體內(nèi)環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞生長。根據(jù)組織分散方式的不同，常用方法主要有以下 4 類：

一、酶消化法（常用）

利用蛋白酶分解組織間的膠原蛋白、彈性蛋白等連接物質(zhì)，使組織分散為單細(xì)胞，適用于多數(shù)實(shí)質(zhì)性組織（如肝臟、腎臟、肌肉等）。

常用酶及特點(diǎn)：

胰蛋白酶（Trypsin）：常用，適用于消化纖維組織少的軟組織（如上皮組織），在 37℃下作用（濃度 0.25%-0.5%），pH 7.2-7.6 時活性最佳，消化后需用含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)（血清可抑制胰蛋白酶活性）。

膠原酶（Collagenase）：對膠原纖維分解能力強(qiáng)，適用于消化纖維組織豐富的組織（如結(jié)締組織、腫瘤組織），無需血清終止，可在含血清的培養(yǎng)基中直接使用。

EDTA（乙二胺四乙酸）：非酶類螯合劑，通過結(jié)合鈣離子破壞細(xì)胞間連接，常與胰蛋白酶混合使用（如 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA），增強(qiáng)消化效果。

操作步驟：

組織剪碎成 1-2mm3 的小塊，用 PBS 清洗 2-3 次去除血污；

加入適量酶溶液（覆蓋組織塊），37℃水浴振蕩消化（時間因組織而異，通常 30 分鐘至數(shù)小時）；

顯微鏡下觀察到多數(shù)細(xì)胞分散后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化；

過濾（用 200 目篩網(wǎng)）去除未消化的組織塊，離心（1000rpm，5 分鐘）收集細(xì)胞；

用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)后接種到培養(yǎng)瓶中。

二、組織塊培養(yǎng)法（簡單易行）

無需酶消化，直接將組織塊貼附于培養(yǎng)容器表面，利用組織塊邊緣細(xì)胞的遷移生長獲得細(xì)胞，適用于纖維組織豐富的組織（如皮膚、肌肉、胚胎組織）或?qū)γ该舾械募?xì)胞。

操作步驟：

組織剪碎成 0.5-1mm3 的細(xì)小塊（越小越易貼壁），PBS 清洗后瀝干；

在培養(yǎng)瓶內(nèi)壁均勻擺放組織塊（間距 0.5cm 左右），翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入少量培養(yǎng)基（僅覆蓋瓶底即可）；

37℃培養(yǎng)箱靜置 2-4 小時，待組織塊貼附后，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（避免組織塊脫落），使培養(yǎng)基淹沒組織塊；

繼續(xù)培養(yǎng)，約 3-7 天后可見細(xì)胞從組織塊邊緣遷出，形成單層時進(jìn)行傳代。

三、機(jī)械分散法（適用于易碎組織）

通過物理方法（如研磨、篩網(wǎng)過濾）分散組織，適用于結(jié)構(gòu)疏松、易于分散的組織（如脾臟、淋巴結(jié)、骨髓等），優(yōu)點(diǎn)是操作快速，對細(xì)胞損傷小。

操作步驟：

組織放入含少量培養(yǎng)基的平皿中，用注射器針頭或玻璃勻漿器輕輕研磨；

研磨后的細(xì)胞懸液通過篩網(wǎng)（100-200 目）過濾，去除雜質(zhì)；

離心收集細(xì)胞，重懸后接種培養(yǎng)。

四、螯合劑處理法（輔助或單獨(dú)使用）

除 EDTA 外，檸檬酸鹽、草酸鹽等螯合劑也可通過破壞細(xì)胞間鈣離子依賴的連接實(shí)現(xiàn)組織分散，常與酶消化法聯(lián)合使用，或用于對酶敏感的細(xì)胞（如上皮細(xì)胞）。

不同方法的選擇原則

酶消化法：優(yōu)先用于需要獲得大量單細(xì)胞、且組織較致密的樣本（如肝臟、腎臟）；

組織塊培養(yǎng)法：適合纖維豐富、酶消化效果差的組織（如皮膚、肌肉），或希望保留更多細(xì)胞間相互作用的場景；

機(jī)械分散法：僅用于結(jié)構(gòu)疏松的組織，避免對脆弱細(xì)胞造成機(jī)械損傷。

無論哪種方法，原代培養(yǎng)的核心是無菌操作和溫和處理（減少對細(xì)胞的損傷），且shou次培養(yǎng)時細(xì)胞密度不宜過低（通常 10?-10? cells/mL），以提高存活率。