ELISA檢測系統(tǒng)可謂是免疫學 反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中最為廣泛最為靈敏的技術(shù)手段。可是在新老手操作過程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題，比如說花板，假陽性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低。

下面就由我來說一下，做ELISA的經(jīng)驗總結(jié):

1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，做重組 蛋白時，一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。

還有有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，我把方法簡要的列出如下:

①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。

②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。

③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。

2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。

應(yīng)注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體 是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。

具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下最終可不可以應(yīng)用到自己試驗當中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA ;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但最終選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐。

4、洗滌板：可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。因為聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。

所以在洗板時會有一定誤差，人為因素很大(當然有條件的用洗板機除外)，洗的不chedi或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響。

5、加抗體標本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用PBS 稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著色淺。

6、顯色:顯色系統(tǒng)又很多，我們一開始做的時候，要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。

7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如出現(xiàn)問題也好分析。

相關(guān)知識：

1、問：做間接Elisa法測試小鼠血清中的IgE抗體，設(shè)空白對照、和陰性對照、陽性血清稀釋倍數(shù)為5千、1萬、10萬、20萬不等，用的是生物素標記的羊抗鼠IgE抗體，和親和素的辣根過氧化物酶?？墒墙Y(jié)果除了空白對照孔沒有顏色外，其余各孔全有顏色，而且OD值都相差不大，為什么?

回答：可能原因如下：

(1) 水質(zhì)被金屬離子等污染;防止辦法盡量使用新鮮水或蒸餾水。

(2) 洗滌不充分，樣品中其它成分殘留或酶殘留;防止辦法洗滌液應(yīng)注滿微孔，充分洗滌。

(3) 移液頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不wanquang; 防止辦法移液頭最好一次性使用。

(4) 酶標板靈敏度過高。

(5) 一抗顯色時間的控制等等，關(guān)于ELISA的每一步都要注意才行。

2、ELISA加樣時的防錯小經(jīng)驗

(1)用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報紙，墊在下面，這樣，加過標本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，非常容易區(qū)分。

(2)可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別

(3)在標本加完后，再把加樣槍全壓下，使液面產(chǎn)生小氣泡，也可以加以區(qū)分

3、棋盤試驗的操作方法:

(1)將抗原按一定的梯度倍比稀釋后，按照ELISA從上到下(或者從左到右)的順序包被。

(2)將抗體按一定的梯度倍比稀釋后按照ELISA從左到右或者從上到下加入。

(3)二抗的稀釋倍數(shù)是一定的，然后顯色，讀值。

OD值的測定時，波長要根據(jù)顯色劑的不同而定，一般上大家都使用TMB顯色，450nm讀值。根據(jù)讀值得結(jié)果可以選定合適的抗原和抗體效價，這就是棋盤 實驗的目的，如果抗原包被量已知而二抗的工作濃度不確定的話就用一抗和二抗作棋盤試驗。