細胞復(fù)蘇技巧，MDL科研助手來支招

細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細胞，也可以是細胞系。細胞復(fù)蘇是細胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，下面小編具體給大家介紹下細胞復(fù)蘇的protocal和注意事項！

01、細胞復(fù)蘇的原理

細胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細胞解凍之后重新培養(yǎng)，細胞恢復(fù)生長的過程。當恢復(fù)到常溫狀態(tài)時，細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常，生化反即刻恢復(fù)。細胞復(fù)蘇過程升溫要快，原則是慢凍快融，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶，影響細胞存活。

02、細胞復(fù)蘇的實驗步驟

1. 從液氮罐中取出凍存管，置于-80℃冰箱數(shù)分鐘，迅速放入37℃水浴鍋中，不時搖動，使其在2min內(nèi)急速融化，注意不要把凍存管的管口沒入水浴中避免引起污染，復(fù)蘇過程中一般細胞死亡率在25%左右；

2. 融化后，凍存管用75％酒精擦拭冷凍管外殺菌后，打開蓋子，取出凍存管的細胞懸液，緩慢加入到有培養(yǎng)液的T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO培養(yǎng)。如果細胞需要去除冷凍保護劑，用移液槍將細胞懸液注入15mL無菌離心管中，

再加5ml培養(yǎng)基，根據(jù)細胞類型選擇合適的離心速度，低速離心5min，棄去上清，加入2-3mL預(yù)熱的培養(yǎng)基，輕輕吹勻，保證細胞重懸；

3. 用培養(yǎng)液適當稀釋后，將重懸的細胞接種到培養(yǎng)皿或者T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO培養(yǎng)，24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，去除死細胞，三天可進一次換液，當細胞長到有80-90%匯合進行傳代。

03、細胞復(fù)蘇的注意事項

1. 取凍存細胞時應(yīng)做好防護措施，戴好防凍手套，護目鏡。如果凍存管密封不嚴，液氮可被吸入。由于解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發(fā)生爆炸。

2. 細胞放入水浴中復(fù)蘇時注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，且速度越快越好，這樣可以最大限度的保存細胞活力，并防止水浴鍋的水進入細胞凍存管造成細胞污染。

3. 打開細胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏?。注意無菌操作，細胞復(fù)蘇后的操作在4℃冰盒中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。

4. 解凍時間在2min以內(nèi)完成，且整個過程盡量避免吹打細胞產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致細胞復(fù)蘇后的生長狀態(tài)不佳。

5. 復(fù)蘇細胞的時候盡量避免凍存管接縫處沾水，防止支原體污染，實驗室定期用過氧化氫熏蒸，細胞小黑點增多時用支原體檢測試劑盒檢測，并且及時清除。

04、如何避免凍存管爆炸

1.  選擇質(zhì)量好的進口內(nèi)旋凍存管，擰緊蓋子，防止液氮進入管內(nèi)，液氮罐的細胞留種用，平時常用的細胞放在-80冰箱。

2. 凍存細胞時盡量加多一點凍存液，比如2ml凍存管加1.8ml凍存液，保留少量空間。

3. 取細胞時帶好手套和防護眼鏡，準備好鑷子，避免手直接接觸凍存管造成手凍傷或炸傷。

4. 從液氮里取出細胞時，先在液氮罐上面的蒸汽里放一會，然后再拿出來，將凍存盒殘余的液氮流到罐內(nèi)，避免拿出時凍傷，也避免細胞從液氮迅速升到室溫發(fā)生爆炸。